Kouichi Inukai, Masaki Watanabe, Youhei Nakashima, et al 摘 要 格列美脲（亚莫利）属于第三代磺脲类药物,主要通过刺激胰岛素分泌发挥降糖作用,也可以通过其它作用途径而发挥效应.最近的研究显示,格列美脲有增加胰岛素敏感性的作用.本实验目的,意在研究格列美脲改善胰岛素抵抗的具体作用机制。我们利用体外培养的脂肪细胞和肌细胞,研究格列美脲对AMP-激活蛋白激酶（AMPK）和过氧化物酶体增殖物激活受体－γ（PPAR－γ）转录活性的影响。研究发现，1mM的格列美脲能够显著增强完全分化的3T3-L1脂肪细胞内源性PPAR-γ转录活性，但是，对C2C12成肌细胞中AICAR诱导的AMPK磷酸化没有影响。格列美脲增强PPAR-γ活性的最大作用大约是1mM吡格列酮作用的20%。 但是，在相同的条件下，其它二代磺脲类药物（如格列本脲），未能观察到这种刺激PPAR－γ活性增强的作用。进一步研究发现，经格列美脲培养的细胞，aP2基因（一种脂肪来源的标志基因）的转录水平在3T3-L1脂肪细胞和成肌细胞中分别增加2.4和3.7倍。通过细胞内甘油三酯含量的测定分析发现，格列美脲能够促进3T3-L1脂肪细胞的分化。这些研究结果提示，格列美脲有潜在的增强PPAR-γ活性并改善胰岛素抵抗的作用。 格列美脲属于磺脲类衍生物，在欧洲和亚洲广泛地用于2型糖尿病的治疗。虽然它促进胰岛素分泌的作用比较温和，但是降糖效果和格列本脲相似。 因此人们推测，这类新的降糖药物可能具有胰腺外的降糖作用。正因为这样，有人把格列美脲划分为第三代磺脲类药物。体外研究显示，格列美脲有激活胰岛素介导的糖原合成作用，能够抑制肝糖生成，增加外周葡萄糖的摄取。多个临床试验和动物研究都显示，格列美脲能够改善胰岛素抵抗。虽然人们已经在这方面进行了广泛的研究，但是对这种作用的具体机制和作用特点尚无明确的结论。 过氧化物酶体增殖物激活受体－γ（PPAR-γ）是核受体超家族的成员之一，在胰岛素调节和葡萄糖代谢中发挥至关重要的作用。PPAR-γ可以被一些合成的复合物（包括噻唑烷二酮类药物）所激活，这些药物已经作为降糖药而用于糖尿病的临床治疗。目前，PPAR-γ活性的调节（包括脂肪细胞内源性PPAR-γ的表达）已经受到广泛的深入研究。最近的研究中，我们建立了通过表达PPAR-γ反应元件（PPRE）-受体基因的组合腺病毒载体，来测定3T3-L1脂肪细胞内源性PPAR-γ转录活性的新方法（详见参考文献）。本项研究，正是利用这个方法，来测定格列美脲对3T3-L1脂肪细胞内源性PPAR-γ转录活性的影响。而且，实验还进一步证实， 格列美脲对PPRE下游的靶基因——aP2基因的转录表达也有影响。我们的实验结果，为阐明“格列美脲通过增强PPAR-γ的活性而促进脂肪细胞分化，从而降低胰岛素抵抗”这一假设，提供了最直接可靠的证据。 材料和方法 ○ 细胞培养 ○ PPAR-γ转录活性的测定 ○ RNA制剂和Northern blot分析 ○ 抗体和Western blot分析 ○ 3T3-L1脂肪细胞甘油三酯含量的测定 结 果 我们采用转录报告测定法来评价不同的药物和磺脲类药物对成熟3T3-L1脂肪细胞内源性PPAR-γ转录活性的影响。和PPRE（＋）－Luc报告基因的细胞相比，缺乏PPRE基因（PPRE（-）－Luc报告基因）的细胞，荧光素酶活性很低，未观察到和药物浓度相关的PPAR-γ转录活性的变化（图1，左边图形）（图1 格列美脲对3T3-L1脂肪细胞内PPAR-γ活性的影响）。通过PPRE (+)－Luc报告基因来测定PPAR-γ的转录活性，我们看到，细胞在10－6M吡格列酮培养24小时以后，PPAR-γ转录活性呈显著性增加（9.1倍），（图1，右边图形，泳道5）。我们进一步测定了格列美脲对PPAR-γ转录活性的影响。格列美脲培养组，PPAR-γ的转录活性呈剂量依赖性地增加2.6倍。即使用最小浓度（1μM）的格列美脲对细胞进行培养，PPAR-γ的转录活性也显著增加（1.21倍，图1，右边图形，泳道2）。另一方面，作为传统磺脲类药物之一的格列本脲，在1μM和5μM的浓度下都不能显著增强PPAR-γ的活性。我们可以看到，当格列本脲的浓度达到10μM时， PPAR-γ的活性才受到显著增强，但是，这个药物浓度已经超过了临床可能的药物限度。剂量－反应曲线对吡格列酮，格列美脲和格列本脲3种药物的不同效能进行比较，它们的EC50值分别为0.2μM, 2.0μM和5.6μM。剂量－反应曲线显示，和格列本脲曲线相比，格列美脲的曲线明显左移并呈现显著性差异。 如果格列美脲能够增强PPAR-γ转录活性的假设成立，那么，那些经PPAR-γ介导的靶基因的活性，可能随着PPAR-γ活性的增强而同步增强。aP2可能就属于这类靶基因。在多个受到PPAR-γ活性调控的基因中，我们选择测定aP2基因的转录水平。这个基因和3T3－L1脂肪细胞的分化以及脂肪代谢有关。用不同浓度的格列美脲培养细胞，我们观察到aP2的表达呈浓度依赖性地增加2.4倍。格列美脲和吡格列酮使得aP2的表达显著上升（图2A）（图2 格列美脲对aP2基因表达的影响）。格列美脲超过一定浓度时（高于20μM），aP2表达的升高达到平台而不再增加（图2B）。通过剂量－反应曲线观察到，PPAR-γ转录活性的增强也出现相似平台。我们还观察到，格列美脲培养的前脂肪细胞（3T3-L1成纤维细胞），aP2的表达也增加（3.7倍，图2C）。这些实验结果提示，在体外，格列美脲能够通过增强PPAR-γ的活性而提高PPAR-γ介导的靶基因活性。 PPAR-γ在脂肪生成和脂肪细胞分化中发挥重要的不可缺少的作用。因此，我们进一步研究了格列美脲对3T3-L1脂肪细胞中脂肪生成的影响。实验通过测定胞浆内脂滴的堆积和甘油三酯的含量，来评价脂肪生成。对照组3T3-L1前脂肪细胞在诱导成功后用血清阴性培养基进行培养，有脂滴聚集的脂肪细胞数量少。相反，经过含1μM吡格列酮的血清阴性培养液48h培养的脂肪细胞，几乎所有的细胞内都有脂滴聚集。当3T3-L1前脂肪细胞经过10μM格列美脲培养，和对照组相比，有脂滴聚集的细胞数目亦有所增加。为了精确评价脂肪生成，我们对3T3-L1脂肪细胞内的脂肪含量进行了测定。经1μM格列美脲培养的3T3-L1脂肪细胞内，甘油三酯含量显著增加（图3 格列美脲对3T3-L1前脂肪细胞内脂肪生成的影响）。这些结果提示，格列美脲能够诱导脂肪生成，这一作用可能是通过诱导PPAR-γ活性的增强而产生的。 讨 论 本项研究采用了腺病毒表达技术，直接测定生理条件下内源性PPAR-γ的转录活性。研究结果为说明格列美脲能够增强PPAR-γ活性提供了有力的证据。试验中，我们测定格列美脲刺激下PPRE介导的内源性PPAR-γ转录活性。很显然，格列美脲的这种药理作用和磺脲受体作用无关，因为脂肪细胞上无磺脲受体的表达。 在临床前研究中，人们已经发现，格列美脲能够改善胰岛素抵抗。所以在此药上市之前，人们就推测它可能通过多种作用途径发挥降糖作用。最近的临床研究发现，120名原来服用传统磺脲类药物（格列本脲，格列齐特）的2型糖尿病患者，换用格列美脲治疗后，胰岛素抵抗得到改善。这些结果提示，格列美脲可能通过多重作用改善胰岛素抵抗，而不仅仅作为一个2代磺脲类药物发挥降糖作用。本研究显示，最低浓度达1μM的格列美脲，能够诱导PPAR-γ活性增加。这个浓度和体内的药物浓度相近。另一方面，格列本脲在临床使用中的最高血药浓度可能是1μM，但我们的实验没有观察到这种浓度的格列本脲有明显增强PPAR-γ活性的作用。 实验能够观察到的激活PPAR-γ所需的最低格列本脲药物浓度是10μM,这个浓度远远超过正常用药情况下的血药浓度。这些结果提示，在生理条件下，相同的药物浓度（1μM），能够不同程度地影响PPAR-γ的活性，提示格列美脲和传统2代磺脲类药物在药理学上存在显著差异。 脂联素是一种和增强胰岛素敏感性有关的激素，只在脂肪组织中产生。脂联素的表达受到PPAR-γ转录活性的调节。虽然其中具体的机制需要进一步阐明，但最近的临床研究显示，经过格列美脲治疗3个月以后，患者的血清脂联素水平明显上升。我们推测，格列美脲可能通过增强PPAR-γ转录活性，增加脂联素的分泌，从而改善胰岛素抵抗。 总之，本试验发现，磺脲类药物——格列美脲，能够通过一个新的作用途径降低血糖，即通过诱导增强PPAR-γ活性而发挥增加胰岛素敏感性的作用。我们的结果强烈提示，格列美脲可以作为首选的磺脲类药物。它不仅适用于β细胞功能受损的非肥胖型糖尿病患者，也适用于肥胖型的以胰岛素抵抗为主的糖尿病患者。 ■ 编译自 Biochem Biophys Res Commun, 2005;328(2):484-90.